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ScreenQuest免洗Rhod-4钙检测试剂盒*1%FBS生长培养基**10板*

钙通量测定法是药物发现中筛选G蛋白偶联受体(GPCR)的**方法。 Screen Quest Rhod-4 NW钙含量测定试剂盒提供了一种基于荧光的均相测定,用于检测细胞内钙的迁移。Rhod-4是可用于HTS筛选的*亮的红色钙指示剂。一旦进入细胞内,Rhod-4 的亲脂性封闭基团就会被非特异性细胞酯酶裂解,产生带负电荷的荧光染料,并留在细胞内部,并且与钙结合后其荧光会大大增强。当细胞被筛选化合物刺激时,受体信号释放细胞内钙,这大大增加了Rhod-4的荧光。 Rhod-4 具有长波长,高灵敏度和大于250倍的荧光增强特性(当与钙形成复合物时),使其成为测量细胞钙的理想指标。此Screen Quest Rhod-4 NW钙测定试剂盒提供了一种优化的测定方法,用于检测G蛋白偶联受体(GPCR)和钙通道。该测定可以用96孔或384孔微孔板进行,并易于适应自动化。齐岳生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供*优质的Screen Quest 免洗Rhod-4钙检测试剂盒。

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适用仪器


荧光酶标仪 
激发:540nm
发射:590nm
cutoff:570nm
推荐孔板:黑色透明
读取模式:底读模式
其他可用仪器:
FDSS, FLIPR, ViewLux, NOVOStar, ArrayScan, FlexStation, IN Cell Analyzer
产品说明书

样品实验方案

简要概述

  1. 准备细胞
  2. 除去生长培养基
  3. 添加Rhod-4 NW染料加载溶液(对于96孔板为100 µL /孔,对于384孔板为25 µL /孔)
  4. 在室温下孵育1小时
  5. 检测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

 

溶液配制

储备溶液配制

1. Rhod-4 NW储备溶液:将100 µL DMSO加入小瓶Rhod-4 NW(组分A)中并充分混合,避光。 注意:10 µL Rhod-4 NW储备液足以装满一块板。

2.分析缓冲液(1X):a)对于#36330(1个板试剂盒)和#363331(10个板试剂盒),通过将9 mL HHBS(组分C)添加到10XPluronic®F127 Plus(1 mL,组分B)中来制成1X分析缓冲液,并充分混合。b)对于#36332(100板试剂盒),通过向10XPluronic®F127 Plus(10 mL,组分B)中加入90 mL HHBS(未包括)制成1X Assay Buffer。 注意:10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的1X分析缓冲液。 避光并避免重复的冻融循环。

 

工作溶液配制

Rhod-4 NW工作溶液:将20 µL Rhod-4 NW储备溶液加入10 mL 1X分析缓冲液中,并充分混合。 注意:该工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

 

实验步骤

1.将100 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的Rhod-4 NW染料加载溶液添加到细胞板中。

2.在细胞培养箱中将染料加载板孵育30分钟,然后在室温下再孵育30分钟。 注意:如果测定需要37℃,请立即进行实验,而无需进一步室温孵育。 注意:如果细胞在室温下能长时间正常工作,请在室温下孵育细胞板1-2小时。 3.准备并添加HHBS或所需缓冲液的复合板。

4.通过检测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度运行钙通量检测。

 

图示

图1.使用Screen Quest Rhod-4 NW分析试剂盒和Rhod-2 AM在HEK-293细胞中测量了卡巴胆碱剂量反应。 将HEK-293细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中过夜接种。 使用Screen Quest™Rhod-4 NW钙测定试剂盒或100 µL Rhod-2 AM溶液(5 µM)在室温下将细胞与100 µL染料上样溶液孵育1小时。 NOVOstar(BMG Labtech)添加了卡巴胆碱(25µL /孔)以达到*终指示的浓度。 使用Rhod-4 NW的卡巴胆碱的EC50约为0.6 µM。

 

参考文献

Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2Authors: Territo PR, Heil J, Bose S, Evans FJ, Balaban RS.Journal: Appl Spectrosc (2007): 138

Kinetic characterization of novel NR2B antagonists using fluorescence detection of calcium fluxAuthors: Bednar B, Cunningham ME, Kiss L, Cheng G, McCauley JA, Liverton NJ, Koblan KS.Journal: J Neurosci Methods (2004): 247

Novel fluo-4 analogs for fluorescent calcium measurementsAuthors: Martin VV, Beierlein M, Morgan JL, Rothe A, Gee KR.Journal: Cell Calcium (2004): 509

Protein kinase C and myocardial calcium handling during ischemia and reperfusion: lessons learned using Rhod-2 spectrofluorometryAuthors: Stamm C, del Nido PJ.Journal: Thorac Cardiovasc Surg (2004): 127

Cytosolic calcium in the ischemic rabbit heart: assessment by pH- and temperature-adjusted rhod-2 spectrofluorometryAuthors: Stamm C, Friehs I, Choi YH, Zurakowski D, McGowan FX, del Nido PJ.Journal: Cardiovasc Res (2003): 695

Calcium measurements in perfused mouse heart: quantitating fluorescence and absorbance of Rhod-2 by application of photon migration theoryAuthors: Du C, MacGowan GA, Farkas DL, Koretsky AP.Journal: Biophys J (2001): 549

Calibration of the calcium dissociation constant of Rhod(2)in the perfused mouse heart using manganese quenchingAuthors: Du C, MacGowan GA, Farkas DL, Koretsky AP.Journal: Cell Calcium (2001): 217

Changes in mitochondrial Ca2+ detected with Rhod-2 in single frog and mouse skeletal muscle fibres during and after repeated tetanic contractionsAuthors: Lannergren J, Westerblad H, Bruton JD.Journal: J Muscle Res Cell Motil (2001): 265

Rhod-2 based measurements of intracellular calcium in the perfused mouse heart: cellular and subcellular localization and response to positive inotropyAuthors: MacGowan GA, Du C, Glonty V, Suhan JP, Koretsky AP, Farkas DL.Journal: J Biomed Opt (2001): 23

Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell deathAuthors: Muriel MP, Lambeng N, Darios F, Michel PP, Hirsch EC, Agid Y, Ruberg M.Journal: J Comp Neurol (2000): 297

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轮双键体系化学结构的化合物,受到紫外光或蓝紫光照射时,可激发成为激发态,当从激发态恢复基态时,发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染,操作简便等优点,使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广。

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本文由齐岳Lh整理,2022-07-25 09:56:04

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